国际著名病理学家Karl Lennert曾经说过:“技术是病理学之母”。病理组织学属于形态学检验,组织病理学是将病变组织制成厚约数微米的切片,经不同方法染色后用显微镜观察其细微病变,对疾病做出病理学诊断。组织病理分析是检验大多数动物模型实验成功与否的金标准。病理学基本检验技术包括组织固定、石蜡制片、苏木素-伊红染色及常用特殊染色技术。
“操千曲而后晓声,观千剑而后识器”,阅读下文自测病理组织学知识你知多少~
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一、石蜡切片与冰冻切片
(一)石蜡切片制备流程
1 | 取材、固定 |
2 | 洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋 |
3 | 切片、捞片、晾片 |
4 | 染色、封片 |
(二)冰冻切片制备流程
1 | 取材、固定 |
2 | OCT包埋 |
3 | 液氮速冻 |
4 | 切片、染色 |
TIPS:石蜡切片和冰冻切片如何选择?
1、冰冻切片优点制片时间短,时间快;缺点保存时间短;
2、石蜡切片对组织的形态保存比冰冻切片好,标本可以长期保存;
3、常规染色,组化优先推荐做石蜡切片;
4、免疫荧光推荐用冰冻切片 (石蜡有自发荧光);
5、脂质染色、ROS染色、 ATP染色,胆固醇染色推荐做冰冻切片。
二、HE染色
苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ,简称HE染色法 ,石蜡切片技术里常用的染色法之一 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
图注:尊龙凯时人生就博官网登录生物HE染色图
1 | 组织固定 |
2 | 包埋 |
3 | 脱蜡 |
4 | 苏木素染色 |
5 | 伊红染色 |
6 | 脱水 |
7 | 封片 |
8 | 观察拍片 |
9 | 结果整理 |
图注:HE染色实验流程图
HE染色过程可能出现问题:
1、HE染色最常见的红蓝失调
偏蓝色:苏木素染色过深,分化不够;伊红试剂过期;伊红染色时间太短,分化过度。
偏红色:苏木素染色过浅,分化过度;组织固定不佳,细胞核不着色;脱蜡不彻底,苏木素染不上;苏木素氧化成熟不够;伊红染色过深,分化不足。
2、HE染色后出现的大白色斑块或斑点
答:脱蜡前烤片温度偏低,时间过短,蜡未完全融化;切片在脱蜡溶剂中停留时间过短;脱蜡溶剂使用太久,得更新。
3、细胞核染色过浅,颜色暗淡
答:切片在苏木素染液中停留过短,或苏木素过度氧化失效,或分化时间太长。对策:重新染色。将组织切片放入0.01%氢氧化钠、0.5%氨水、饱和的碳酸氢钠溶液、乙醇溶液,每个3-5min即可,接着重新染色。可以适当地组织的嗜碱性以增强核染色,如Zenker液固定的切片可放入5%碳酸氢钠溶液中3h,自来水冲洗5-10min染色,或Bouin液固定的切片可放入5%碳酸氢钠溶液中1h,自来水冲洗10min染色。
4、细胞核染色过深,胞浆着蓝色
答:切片在苏木素染液中停留过长;或切片太厚;或分化时间太短。这种情况首先镜下看看切片厚度(最佳厚度1-2层细胞核),要么重新染色,要么重新制片。
5、细胞核呈棕红色改变
答:苏木素染液过度氧化;或苏木素染色后反蓝不足导致。应该立即更换苏木素染色液。或在流动自来水(一般自来水PH7.5-7.8),或在稀释的氨水溶液,或在0.2%碳酸氢钠中适当浸泡,这些步骤均可一定程度地加强苏木素染色后的反蓝效果。
6、伊红染色较淡
答:伊红的PH改变了(PH可能已大于5);或反蓝液体未漂洗干净,残留后影响胞浆嗜酸性染色;或者切片太薄并且在随后的脱水步骤停留过久。对策:检查伊红染色液PH,可采用乙酸调至4.6-5.0。根据以上提示,调整实验步骤。
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三、免疫组化
免疫组化是应用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及相对定量的研究,称为免疫组织化学技术。
图注:尊龙凯时人生就博官网登录生物免疫组化图
1 | 组织固定 |
2 | 包埋 |
3 | 脱蜡 |
4 | 抗原修复 |
5 | 封闭 |
6 | 一抗孵育 |
7 | 二抗孵育 |
8 | DAB显色 |
9 | 苏木素复染 |
10 | 观察拍照 |
11 | 封片 |
12 | 脱水透明 |
图注:免疫组化实验流程图
图注:尊龙凯时人生就博官网登录生物其他染色图
四、各类组织常见染色方法及指标
组织类型 | 实验方法 | 具体检测项目名称 |
脑 | 常做特殊染色 常做组化荧光指标
| TTC(脑梗),尼氏染色,甘安银染色,LFB染色,高尔基染色,刚果红染色,FJB染色 |
心脏 | 常做特殊染色 常做组化荧光指标
| TTC(心梗),mason(心梗),天狼猩红(心梗),冰切油红(动脉粥样硬化,主动脉瓣) |
主动脉
| 常做特殊染色
常做组化荧光指标 | EVG,大体油红,冰切油红,movant五色法
a-SMA,VWF,VIII,VEGF |
肝
| 常做特殊染色 常做组化荧光指标 | PAS染色,冰切油红,mason,天狼猩红
炎症:CD3,CD4,CD8,CD68,F4/80,MPO,Ly6G,CD11c,CD11b,IL2,IL4,IL6,IL8,IL10,TGFb,Tonfa;纤维化:Tonfa-SMA,FN,LN
|
肾
| 常做特殊染色 常做组化荧光指标
| PAS染色,PASM染色,mason,天狼猩红
纤维化:Tonfa-SMA,FN,LN
|
肺
| 常做特殊染色 常做组化荧光指标
| HE染色,PAS染色,mason,天狼猩红,Wiegert间苯二酚碱性品红染色
炎症:CD3,CD4,CD8,CD68,F4/80,MPO,Ly6G,CD11c,CD11b,IL2,IL4,IL6,IL8,IL10,TGFb,Tonfa;纤维化:Tonfa-SMA,FN,LN
|
胃
| 常做特殊染色 常做组化荧光指标
| HE染色,PAS染色,阿利新蓝染色,AB-PAS染色,肥大细胞染色
c-kit,GLP-1,ZO-1,claudin,occluding
|
肠
| 常做特殊染色常做组化荧光指标 | HE染色,PAS染色,阿利新蓝染色,AB-PAS染色,肥大细胞染色 c-kit,GLP-1,ZO-1,claudin,occluding |
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